Vyšetření kostní dřeně: minoritní populace z pohledu onkologické cytologie

V kostní dřeni (KD) se fyziologicky kromě buněk erytroidní, myeloidní a megakaryocytární linie nachází populace, jejichž proliferace může být dána jak benigním, tak maligním procesem:

lymfocyty, plazmatické buňky, mastocyty, makrofágy, histiocyty, osteoklasty, osteoblasty a stromální buňky.Identifikace maligního procesu na základě cytologického vyšetření je často obtížná, rozhodnutí se někdy opírá víc o další klinicko-patologické nálezy než o splnění často vágně definovaných kritérií. Hlavním vodítkem ale přes to zůstává kvantifikace těchto subpopulací a jejich morfologie.Obecně jsou maligní procesy v kostní dřeni zastoupeny minoritně. Z celkového počtu 717 provedených aspiračních biopsií KD tvořily neoplastické procesy necelých 18 % (Weiss 2006).

Vyšetření KD je klíčovým nejenom pro identifikaci primárního nádorového onemocnění KD jakým jsou leukemie, ale rovněž v procesu stagingu, zejména hematopoetických tumorů pro jejich horší prognózu v případě konfirmace nádorové infiltrace. Mezi nálezy v jednotlivých odběrových místech však můžou být zjištěny významné rozdíly. Podle poznatků z humánní medicíny může odběr KD v jiné lokalizaci zvýšit záchyt neoplastické populace téměř o 20 % (Wang et al. 2002). Kromě nerovnoměrné distribuce nádorových buněk komplikuje diagnostiku také vysoký počet cirkulujících neoplastických buněk, podobně jako leukocytózní stavy znesnadňují interpretaci zánětlivé infiltrace.

Při dobře zvládnuté metodice odběru je % nereprezentativních vzorků nízké, méně než 2 % (Weiss 2006), u pacientů s neoplastickou infiltrací KD (zejména lymfomem nebo mastocytomem) však může být vyšší, kolem 13 % (Aubry et al. 2012). Přehled kategorií nálezů získaných vyšetřením 717 aspirátů KD s nejčetnějšími diagnózami (u onkologických pacientů s kompletním výčtem) uvádí tab. 1 (Weiss 2006).Tab. 1 Zastoupení cytologických diagnóz v aspirátách kostní dřeně (Weiss 2006)

Diagnostická kategorieZastoupení z celkového počtu KD
Nespecifické sekundární změny26,1 %
Erytroidní hyperplazie8,0 %
Panhyperplazie4,5 %
Granulocytární hyperplazie3,3 %
Ostatní10,3 %
Nenádorová primární onemocnění bez dysplazie24,3 %
Myelonekróza5,6 %
Imunitně zprostředkovaná anémie4,9 %
Imunitně zprostředkovaná trombocytopenie4,0 %
Ostatní9,8 %
Dysmyelopoeza8,7 %
Sekundární dysmyelopoeza4,7 %
Myelodysplastický syndrom3,8 %
Ostatní0,2 %
Neoplastická onemocnění17,5 %
Akutní leukemie6,4 %
Lymfom3,9 %
Multipní myelom3,5 %
Maligní histiocytóza1,5 %
Chronické leukemie1,0 %
Sarkom0,7
Mastocytom0,4 %
Karcinom0,1 %
Bez nálezu21,8 %
Nediagnostické vzorky1,6 %

Lymfocyty

Lymfocyty tvoří u psů v kostní dřeni do 10 % všech jaderných buněk (all nucleated cells, ANC), s dominantním zastoupením malými lymfocyty, ojediněle pak prolymfocyty a lymfoblasty. U koček představují lymfocyty významnější populaci, cca 15-20 % ANC (Grindem et al. 2002).

Lymfom je nejčastější neoplastický proces v kostní dřeni. Diagnostikován je přibližně u 22 % všech maligních změn identifikovaných v aspirátech KD, přičemž zastoupení samotných lymfocytů v KD se pohybuje v širokém rozmezí, 6 – 68 % (Weiss 2006). Častěji než lymfom jsou z nádorových onemocnění v KD identifikovány pouze akutní leukemie, zastoupení jednotlivých subtypů akutních leukemií je však již svojí četností za lymfomem (Aubry et al. 2012).

Z cytologického hlediska je zásadním odlišení přítomnosti lymfocytů v důsledku stimulace imunitního systému od lymfomu s infiltrací KD (stádium V), příp. lymfoidní leukemie. Kritéria pro přítomnost metastatického lymfomu nejsou jednoznačně definována, obecně je akceptována limitní hodnota víc jak 20 % lymfocytů z ANC a/nebo přítomnost atypických lymfocytů (Grindem et al. 2002).

Indikace k aspiraci KD v rámci WHO stagingu lymfomu není jednoznačně vymezena. Stádium V je obecně spojováno s výrazně horší prognózou (Vail a Young 2007). Významnou roli při stanovení prognózy však hraje také konkrétní subtyp lymfomu (Aresu et al. 2013). Důkladný onkologický staging může pomoct selektovat pacienty, kteří budou z agresivnější terapie zahájené na základě identifikace neoplastických lymfocytů v KD profitovat. Nebo naopak, u prognosticky nepříznivých stavů, usnadnit rozhodnutí o eutanázii (Marconato et al. 2008). Úspěšnost kurativní terapie totiž závisí na eradikaci všech nádorových buněk, čehož lze docílit pouze adekvátním posouzením míry diseminace primárního nádorového onemocnění. Absence infiltrace KD společně v kombinaci s centroblastickým subtypem lymfomu, imunofenotypem B, absencí anémie a hyperkalcemie (ionizované frakce) charakterizovala 11/13 psů s přežitím delším než 2 roky (Marconato et al. 2011).

Vzhledem k uniformní distribuci neoplastických lymfocytů se aspirace z jednoho místa (humerus nebo os illium) pro staging lymfomu jeví jako postačující (Aubry et al. 2012). V humánní medicíně je ale u pacientů s non-Hodgkinovým lymfomemunilaterálně pozitivních až necelých 10 % vzorků (Wang et al. 2002). Oficiální doporučení Veterinary Cooperative Oncology Group (2009) nenavrhuje aspiraci KD jako obligátní vyšetření v rámci onkologického stagingu u pacientů s lymfomem s výjimkou cytopenických stavů. V souboru 60 psů s large B-cell lymfomem však neměla v periferní krvi žádné abnormality až polovina pacientů. Pomocí průtokové cytometrie byl následně zjištěn víc než 5násobně vyšší podíl CD 21+ lymfocytů v KD téměř u třetiny z nich. CD 21+ lymfocyty tvoří jak u zdravých, tak u zvířat se systémovými reaktivními procesy méně než 1 % všech jaderných buněk KD. Pokud by se prováděla aspirace pouze u pacientů s cytopenií, táto skupina by zůstala nerozpoznána (Martini et al. 2013).

Incidence stádia V je relativně vysoká, 32-38 % (Flory et al. 2007, Aubry et al. 2010). Navíc, výrazná většina těchto pacientů (83 %) má klinické příznaky (stadium Vb). Z celkového počtu symptomatických pacientů pak pacienti s infiltrací KD tvoří rovněž většinu, 70 % (Aresu et al. 2013). Lze tedy konstatovat, že je-li prezentován pacient s klinickými příznaky, je pravděpodobnost, že bude mít nádorové buňky v KD poměrně vysoká. Nejčastěji byl diagnostikován agresivní T-lymfom, jehož incidence byla u psů ve stadiu V 2x vyšší než u ostatních podkategorií lymfomu. Ve stádiu V byli zároveň také všichni pacienti s indolentním T-lymfomem. Na druhou stranu, absence klinických příznaků infiltraci KD nijak nevylučuje. Mezi asymptomatickými jedinci mělo pozitivní nález v KD přibližně 12 % pacientů (4/34).

Odhalení infiltrace KD na základě hematologického vyšetření není spojeno s přijatelnou senzitivitou. U necelých 38 % pacientů ve stádu V nejsou neoplastické lymfocyty v periferní krvi pozorovány. Naopak cirkulující neoplastické lymfocyty nemusí nutně pocházet z KD, ale ze sleziny (Flory et al. 2007). Naproti tomu, téměř polovina pacientů, u nichž byla v periferní krvi zjištěna alespoň jedna definovaná abnormalita (anémie, trombocytopenie, leukocytóza, neutrofílie, neutropenie, lymfocytóza lymfopenie nebo přítomnost atypických lymfocytů v nátěru) měla potvrzenou infiltraci KD (na základě průkazu víc než 5% populace CD 21+ lymfocytů), přičemž u většiny z nich (60 %) byla infiltrace výrazná, signifikantně vyšší pak u pacientů s trombocytopenií, leukocytózou nebo lymfocytózou, s počtem trombocytů navíc negativně korelující. Trombocytopenii a přítomnost víc než 10 % velkých lymfocytů v periferní krvi lze aplikovat jako faktory predikující infiltraci KD hodnocené i na základě cytologického vyšetření (Graff et al. 2011), které je ve srovnání s průtokovou cytometrií méně senzitivním i specifickým (Comazzi a Gelain 2011).

Plazmatické buňky

U zdravých zvířat představují plazmocyty (plasma cells, PC) v kostní dřeni jenom si 2-3 % ANC, jejich distribuce je však nerovnoměrná a navíc se mohou nacházet i v malých clusterech, což jejich kvantifikaci na malé ploše znepřesňuje. Někdy lze v KD pozorovat také přítomnost Mottových buněk, plazmocytů s cytoplazmou vyplněnou Russellovými tělísky (Grindem et al. 2002).

Jako plazmocytární hyperplazie provázející chronickou imunitní stimulaci je hodnocena přítomnost PC nad 5 % z ANC. Ke konfirmaci diagnózy mnohočetného myelomu (MM), který tvoří přibližně 8 % hematopoetických malignit, je kritérium nastaveno na identifikaci populace PC v počtu alespoň 20 % z ANC. Kromě plazmocytózy kostní dřeně je u MM však nutné splnění ještě alespoň jedné z dalších 3 podmínek: průkazu monoklonální gamopatie v séru, Bence-Jonesovy bílkoviny v moči nebo lytických kostních lézí (Interational Myeloma Working Group, 2003). U koček, na rozdíl od psů, je však osteolýza pozorována jen vzácně, infiltrace KD je potvrzena u méně než poloviny pacientů s plazmocytárními neoplaziemi (Mellor et al. 2006). Ložiskově mohou pak plazmatické buňky u MM dosahovat extrémních počtů, v aspirátech lze dokonce pozorovat až úplnou repopulaci KD plazmocyty (Geigy et al. 2013, Souchon et al. 2013). Cílený odběr z míst lytických lézí obvykle přináší cytologicky diagnostické vzorky, náhodný odběr KD však zdaleka být diagnostickým nemusí.

Samotná morfologie plazmatických buněk u MM může být variabilní, od dobře diferencovaných po anaplastické. Jsou-li plazmatické buňky nízce diferencované je k odlišení ostatních kulatobuněčných neoplazií nutné imunohistochemické vyšetření bioptátů (Palgrave et al. 2010). Pomocnými morfologickými kritériemi zejména u ne zcela rozvinutého MM s nižším procentuálním zastoupením PC k odlišení neoplastického procesu od reaktivní plazmocytární hyperplazie jsou: přítomnost větších clusterů PC, anizocytóza, anizokaryóza, vysoký N:C poměr a binukleace (Weiss 2006). Mnohočetný myelom je nutné zvažovat i při absenci nálezu plazmatických buněk jsou-li u pacientů detekovány lytické kostní léze, příp. hyperkalcémie nebo transientní cytopenie. Příčinou může být vzácně se vyskytující nesekreční forma MM, u které nelze prokázat přítomnost monoklonální gamopatie ani Bence-Jonesonovy bílkoviny (Lautzenhiser et al. 2003, Souchon et al. 2013).

Mastocyty

Výskyt mastocytů v kostní dřeni je u zdravých zvířat zcela ojedinělý. Jejich přítomnost i kvantita v KD je častěji projevem řady jiných onemocnění než diseminované formy mastocytomu (Grindem et al. 2002). Jako kritérium pro potvrzení metastatické populace mastocytů v KD jsou akceptovány 2 formulace: přítomnost víc jak 10 % mastocytů z ANC nebo přítomnost víc než 5 % atypických mastocytů z ANC (Marconato et al. 2008, Aubry et al. 2012).

Incidence metastatického mastocytomu (mast cell tumor, MCT) se pohybuje kolem 0,4 % ze všech vyšetřovaných aspirátů KD (Weiss 2006). Na rozdíl od lymfomu se však zdá, že u high-grade mastocytomů není distribuce nádorových buněk uniformní. Pozitivní záchyt může být prokázán pouze v jedné lokalizaci, zatímco aspirát z jiného odběrového místa u stejného pacienta může být vyhodnocen jako negativní. Je-li u mastocytomu indikován odběr kostní dřeně, měl by být proveden ze dvou 2 distantních míst (např. humerus a os illium). Postižení kostní dřeně však nijak nekoresponduje se stranou, na které je identifikován primární tumor (Aubry et al. 2012).

Průkaz infiltrace kostní dřeně u MCT je spojen s velmi nepříznivou prognózou, s mediánem přežití pouze 43 dní (Marconato et al. 2008). Metastáze do kostní dřeně je u MCT však spíše ojedinělou. Z celkového počtu 157 psů s kožním mastocytomem byla potvrzena iniciálně pouze u necelých 3 % pacientů. Při opakované aspiraci KD z důvodu restagingu onemocnění však stoupnul záchyt až na téměř 19 % (Endicott et al. 2007). U high-grade MCT však může i iniciálně dosáhnout až 21 % (Aubry et al. 2012).

Jako faktory signifikantně asociované s infiltrací KD mastocyty byly identifikovány: anémie, leukocytóza, neutrofilie, monocytóza, eozinofilie a trombocytopenie. Na druhou stranu až u 36 % (5/14) psů s potvrzeným nálezem neoplastických mastocytů v KD se nemusí v krevním obrazu objevit žádná abnormalita. Důležitým z hlediska stagingu je zjištění, že u všech těchto 14 pacientů byl současně diagnostikován pozitivní záchyt mastocytů také v regionální MU, přičemž slezina nebo játra byly infiltrovány až u 93 % (13/14) psů (Marconato et al. 2008).

Aspirace KD u mastocytomu tedy není indikována jako součást rutinního stagingu. Na souboru 220 psů s MCT nebyla distantní metastáze potvrzena bez současně diagnostikované lokální metastáze ani u jednoho zvířete. K aspiraci KD by se mělo přistoupit: u pacientů s abnormálním hemogramem/leukogramem, u pacientů s recidivou, progresí (růstem) tumoru nebo objevením se nového tumoru a u psů s histologicky potvrzeným MCT grade II nebo III s konfirmovanou metastází do regionální MU a jater nebo sleziny. U žádného z jedinců s MCT grade I nebyla zjištěna infiltrace KD, což odpovídá jeho naprosto minimálnímu metastatickému potenciálu. Výskyt multipních mastocytomů se nezdá být spojen s vyšším rizikem metastatického rozsevu (Edincott et al. 2007, Warland et al. 2012).

Histiocyty/Makrofágy

Histiocyty a makrofágy se v aspirátech KD zdravých zvířat vyskytují pouze sporadicky, tj. tvoří méně než 1 % ANC (Grindem e al. 2002). Odlišení proliferace histiocytů v KD provázející systémovou histiocytózu, granulomatózní onemocnění a imunitně zprostředkovaná onemocnění od diseminovaného histiocytárního sarkomu (DHS, dříve maligní histiocytózy) vycházejícího z maligně transformovaných makrofágů je postaveno na morfologických kritériích. Zatímco u benigních histiocytárních onemocnění jsou nacházeny dobře diferencované histiocyty, u maligní varianty lze snadno identifikovat četné atypie: buněčný pleomorfizmus, obrovské mnohojaderné buňky, anizokaryózu, multinukleaci, atypická jadérka, vysoký N:C poměr, četné a atypické mitózy (Brown et al. 1994, Moore 2014). Incidence postižní kostní dřeně je u DHS relativně vysoká (11/20), z hlediska četnosti je hned za slezinou a mízními uzlinami (Affolter a Moore 2002). Počet maligních histiocytárních buněk v KD je u diseminovaného histiocytárního sarkomu zpravidla vysoký, nad 30 % ANC (Weiss 2006).

U hemofagocytární varianty DHS, která má nejhorší prognózu ze všech histiocytárních nemocí (s mediánem přežití pouze 28 dní) je pozitivní záchyt v KD prokázán téměř u všech pacientů (10/11). Od klasické formy histiocytárního syndromu se tato varianta liší přítomností fagocytózy erytrocytů, leukocytů, příp. samotných nádorových buněk (Brown et al. 1994, Moore 2014). Cytologicky však i u hemofagocytárního DHS mohou být přítomné buňky dobře diferencované, buněčné atypie jsou častěji identifikovány ve slezině (Moore et al. 2006). Na druhou stranu, v rámci celého hemofagocytárního syndromu (s průkazem alespoň 3 % makrofágů z ANC se známkami erytrofagocytózy), jsou buněčné atypie relativně častým nálezem i u benigních diagnóz, resp. variant provázejících jiná hematoonkologická onemocnění. Samotné vyšetření KD bez dalších nálezů proto nemusí vést k jednoznačnému diagnostickému závěru (Weiss 2001).

Autor:

Foto Kristína Řeháková

MVDr. Kristína Řeháková, Ph.D.
VetHelp
Grohova 3
602 00 Brno
Česká Republika
e-mail: rehakovak@vfu.cz