Molekulární metody

Průtoková cytometrie

Úvod a princip metody

Průtoková cytometrie (FCM) je senzitivní a specifickou metodou pro simultánní analýzu různých parametrů jednotlivých buněk  proudící suspenzi. Průchodem buněk přes laserový paprsek je na principu optického odrazu a lomu od jednotlivých částic tento paprsek modifikován a následně pomocí fotonásobičů přeměňován na elektrický signál, který je dále zpracován a vyhodnocen počítačem. Pomocí fluorochromy značených specifických protilátek proti jednotlivým CD („cluster of differentiation“) antigenům jsme schopni identifikovat jednotlivé subtypy buněk. Se zvyšující se dostupností nových specifických protilátek tuto metodu progresivně využívá veterinární onkologie jako součást diagnostiky hematonkologických onemocnění či  imunodeficienčních syndromů. Výhodou FCM je především rychlost vyšetření vzorků (do několika hodin) a detailní typizace buněk. Vzhledem k nemožnosti použít humánní sety protilátek k vyšetření zvířecí krve a vysoké pořizovací ceně přístroje však není tolik rozšířená v nabídce služeb běžných laboratoří. V českých podmínkách tak toto vyšetření nabízí pouze Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. (VÚVeL) v Brně a zahraniční laboratoře v českém zastoupení (Laboklin, Německo).

Odběr a zpracování vzorků

Pro dosažení objektivních výsledků z průtokové cytometrie je preanalytická fáze významným momentem celého procesu. Vzhledem k tomu, že se vyšetřují živé buňky, mělo by k analýze vzorku dojít do 24 hodin (maximálně do 48 hodin) po odběru.Pokud to tedy okolnosti dovolují, je vhodné odběr vzorků naplánovat s klientem tak, aby se logisticky podařilo vzorek ihned odeslat přímo do laboratoře. V případě čekání na kurýra je doporučeno vše uchovat v lednici a vzorek odeslat dále zchlazený (nikoliv zmražený). Životnost buněk v suspenzi lze zvýšit i jejím uchováním v EDTA médiu nebo v plazmě. Nejvíce náchylné jsou k mechanickému i časovému poškození právě blasty. Při samotném odběru je třeba co nejvíce eliminovat případnou kontaminaci vzorku cizorodým materiálem a vyhnout se sraženinám. Pro snížení rizika mechanického poškození buněk je doporučeno během celého procesu se vzorkem manipulovat šetrně bez zbytečného třepání.

Jak vyplývá z principu metody – všechny vzorky určené k vyšetření průtokovým cytometrem musí být zpracovány jako tekutá suspenze buněk. Vzorky krve, kostní dřeně či tělesných tekutin je vhodné odeslat ve zkumavce s EDTA médiem. Pevné části (např. biopsie orgánů či mízní uzliny) se vyšetřují jako homogenní suspenze živých buněk v ní obsažených. Bioptát je tedy ideální transportovat např. v menším množství fyziologického roztoku (nikoliv ve formalínu!). Tkáňové tenkojehelné aspirace je doporučeno odeslat např. ve zkumavce s cca 1-2ml NaCl, limitující je zde ale počet buněk: minimálně 0,5 – 1 milionu buněk/ml. Z praktického hlediska bychom měli pozorovat makroskopický materiál zaujímající cca 3 a více milimetrů ode dna zkumavky (tento materiál by neměl být krvavého charakteru, naopak optimálně charakteru hnisu či tkáně).

Indikace vyšetření

Průtoková cytometrie je využívána především v hematonkologii, kde na základě imunofenotypizace můžeme lépe definovat jednotlivé buněčné subtypy. Dosáhneme toho pomocí specifických monoklonálních protilátek vázaných na jednotlivé CD buněčné antigeny. Je důležité upozornit, že jednotlivé sety protilátek nepoužívá každá laboratoř stejné a způsobů určení jednotlivé buněčné linie tak může být více. Vše se může navíc komplikovat důsledkem aberantní („falešné“) exprese jednotlivých CD antigenů u některých typů onemocnění. FCM tak nemusí přinést definitivní výsledek. U sporných případů je tedy nutné znát limity tohoto vyšetření a požádat laboratoř o upřesnění výsledné buněčné linie pomocí jiného CD markeru (pokud je ovšem k dispozici – některé jsou stále ve vývoji) či provést verifikaci výsledků jiným vyšetřením (histopatologie + imunohistochemie, PARR klonalita). Pro lepší orientaci v problematice CD markerů jsou některé z nich uvedeny v následujcí tabulce:

Mezi základní úkoly FCM patří diagnostika a subtypizace jednotlivých forem lymfomů. Klasifikace je založená na určení T (CD3, CD4, CD5, CD8) nebo B (CD 79a, CD20, CD21,  MHC II, IgM nebo IgG) lymfoidních znaků. Na základě určení konkrétní linie (à konkrétního subtypu lymfomu) jsme schopni lépe předvídat očekávanou prognózu a odezvu na zvolenou chemoterapii (u případů s aberantní expresí je prognóza i odezva na terapii horší). Pro pochopení souvislostí zde zmiňuji, že pomocí PARR klonality není možné stanovit jednotlivé CD znaky a s tím související subtyp lymfomu (PARR od sebe odlišuje a potvrzuje pouze B a T imunofenotyp lymfomu).

Dalším neméně důležitým přínosem FCM je stanovení stupně zralosti buněk na základě přítomnosti či nepřítomnosti konkrétních povrchových antigenů. Z toho vycházíme především v diagnostice jednotlivých typů leukémií a jejich odlišení od stádia V leukemizujících lymfomů. To má významný prognostický i terapeutický význam. Neoplazie vycházející primárně z prekurzorových buněk (akutní leukémie) exprimují na svém povrchu membránový glykoprotein CD34, bez rozdílu, jestli vycházejí primárně z myeloidní nebo lymfoidní řady. Oproti tomu u maturovaných buněk dochází při opuštění kostní dřeně ke ztrátě tohoto glykoproteinu. Lymfomy jsou tedy až na vyjímky CD34 negativní. Za aberantní expresi CD34 se považuje stav, kdy krev ani kostní dřeň není infiltrována neoplastickými buňkami a zbývající antigeny poukazují svými výsledky na neoplazii z maturovaných lymfoidních buněk, tedy na lymfom. Wilkerson a kol. 2005 zaznamenala těchto CD34+ aberantních lymfomů cca 5%.

T-lymfocytární prekurzory ztrácí svoji CD34+ při vstupu do kůry thymu a během dozrávání exprimují specifické antigeny CD5 a CD3 (nejprve uvnitř cytoplazmy a později na buněčné membráně). Další diferenciace T-lymfocytů je spojená s přechodem od tzv. dvojitě negativních (CD4-CD8-), přes dvojitě pozitivní (CD4+CD8+) do závěrečné fáze, kdy se z těchto buněk diferencují buď tzv. T-helper (CD4+CD8-) nebo T-cytotoxické (CD4-CD8+) lymfocyty. Znalostí těchto okolností můžeme pomocí FCM odlišit thymom(obsahuje populaci více jak 10% CD4+CD8+) od mediastinálního lymfomu(zastoupení CD4+CD8+ je maximálně 2% nebo je neobsahuje vůbec). Užitečnou informací může být i schopnost FCM rozpoznat různou velikost buněk (buňky mediastinálního lymfomu jsou větší než lymfocyty thymomu).

FCM je užitečnou metodou v rámci určení stagingu lymfomů, především pak v odlišení stádia I-IV od stádia V (infiltrace kostní dřeně). To lze určit po vyšetření krevního nátěru či aspiraci/biopsii kostní dřeně i cytologicky, ale zejména u případů malobuněčných lymfomů může takto dojít k falešné záměně za reaktivní populaci lymfoidních buněk. V kombinaci cytologie a FCM tak dle některých autorů můžeme dosáhnout téměř 100% specifity a sensitivity, protože FCM je schopna detekovat i 1% infiltraci nádorových buněk. Specifita této metody však také závisí na daném subtypu neoplastické populace. Nejčastěji se u psů vyskytuje difuzní velkobuněčný B-lymfom (DLBCL), který je charakterizován velkými CD21+ CD79+ buňkami. Ty mohou být touto metodou snadno rozpoznány. Obtížnější situace však může nastat u některých malobuněčných B a CD4+ T-lymfomů, které mohou exprimovat aberantní fenotypy a ztěžovat tím případnou diagnostiku. Zjištění infiltrace kostní dřeně má zásadní vliv na prognózu a dle recentních studií i na terapii v podobě implementace cytarabinu do konvenčních chemoterapeutických protokolů. To má za následek prodloužení střední doby přežívání u těchto pacientů.

Podobná technika stagingu může být použita i v rámci posouzení infiltrace jiných orgánů, jako jsou játra nebo slezina. Existuje zde však riziko, že v rámci krevní kontaminace v aspirátu a nižší celularity bioptátů nebude koncentrace populace neoplastických buněk dostačující pro posouzení průtokovým cytometrem. V těchto případech je přínosnější doplnit či nahradit vyšetření o PARR klonalitu. Z hlediska prognózy či terapie však v současnosti nejsou známy rozdíly mezi pacienty s infiltrací jater či sleziny oproti těm, kteří jsou postiženi multicentrickou nodální formou lymfomu.

Imunofenotypizace buněk ze zvětšených mízních uzlin může být užitečná pro odlišení lymfoidních a histiocytárních neoplazií, které mohou lymfom imitovat. Cytologie samotná je totiž v těchto případech sama o sobě nedostatečná (zejména u anaplastických neoplazií). Detekce panleukocytárních markerů CD45 a CD18 (při současné další absenci B a T markerů) ve většině případů vylučuje diagnózu lymfomu. Pro korektní potvrzení diagnózy je však doporučeno použití specifických histiocytárních markerů (CD1, CD11c, CD11d).

Oproti cytomorfologickému vyšetření je FCM senzitivnější i specifičtější v rámci sledování minimální reziduální chorobyu pacientů po terapii onkologického onemocnění. S nástupem PARR klonality se však této modality využívá jen okrajově – díky schopnosti detekce aberantních fenotypů především v případech falešně negativních výsledků u PARR (nedostatečná citlivost primerů vedoucí k diagnostickému závěru polyklonální populace).

Kromě toho nabízí FCM zejména v humánní medicíně i některé další aspekty diagnostiky, jako např. určení (pseudo)klonality buněk či schopnost kvantifikovat konkrétní antigenní expresi. Toho lze využít např. k diferenciaci různých stádií maturace B-buněk a vyslovení prognostických faktorů u některých typů lymfomů (např. výrazně kratší doba přežívání u periferních T-lymfomů, které vykazovaly nízkou expresi třídy MHC II a CD45+ oproti skupině s vysokou expresí MHC II a CD45-). Kvantifikovat lze i elevaci exprese u aspirátů z mízních uzlin oproti rezidentní populaci buněk. Míra klinického dopadu i samotného užití ve veterinární medicíně je však z velké části ve fázi výzkumu (ve Vídni již i klinické využití). Určení klonality buněk pomocí FCM je u psů naopak neefektivní v důsledku užšího poměru kappa a gamma řetězců u B-buněk než je tomu lidí či relativní složitosti stanovení u T-buněčné populace. Z toho důvodu se ve veterinární medicíně využívá pro určení klonality metoda PARR.

Závěr:

Průtoková cytometrie je rychlou a cenově dostupnou diagnostickou metodou ve veterinární onkologii. V našich podmínkách je nejvíce využívána v rámci diagnostiky leukémií a jejich odlišení od stage V lymfomů v periferní krvi. Možností k jejímu využití ale nabízí veterinární onkologie mnohem více. Je však třeba znát i její limity, mezi které patří především nutnost vyšetření vzorku do 48 hodin (u očekávaných neoplazií blastického typu vzhledem k vyšší fragilitě nádorových buněk pak ideálně do 24 hodin). Nevýhodou je i malý počet laboratoří nabízejících tuto službu v našem prostředí. U komplikovaných případů je nutné znát pozadí očekávané patologie s ohledem na možnost výskytu aberantních fenotypů. Očekávanou diagnózu je pak v těchto případech nutné potvrdit potvrdit jiným vyšetřením jako je histopatologie s imunohistochemií či PARR klonalita.

Kontakt na pracoviště nabízející FCM v našich podmínkách:

• VÚVeL Brno: MVDr. Martin Faldyna, Ph.D.: faldyna@vri.cz, mob. +420 777 786 695 (před odběrem vzorků ideálně vše osobně domluvit)
• Laboklin: MVDr. Kateřina Škorová: czech@laboklin.com(odběr vzorků nutno synchronizovat především s časem odvozu transportní společností, jinak platí stejná pravidla jako pro ostatní vzorky – žádanka, atd.)
• Vetmeduni Vienna: Barbara Rütgen DVM: barbara.ruetgen@vetmeduni.ac.at(pouze po osobní domluvě)

PARR klonalita

PARR (= PCR for antigen receptor gene rearrangement) klonalita je společně s morfologickým vyšetřením jako je histopatologie a cytologie součástí zlatého standardu diagnostiky lymfomu u psů a koček. Pomocí PARR jsme schopni odlišit  mono-/oligoklonální populaci lymfocytů typickou pro lymfomy oproti polyklonální populaci u reaktivních lymfocytárních procesů.

Metoda funguje na základě určení klonality receptorů B a T buněk, k jejichž genovému přeskupování dochází v rámci jejich přirozeného vývoje. Tato detekce probíhá na základě PCR analýzy T-buněčných receptorů (TCR) u T-buněk a receptorů pro imunoglobulin (Ig) u B-buněk. Výsledkem je u benigní populace to, že se každý lymfocyt svým TCR nebo Ig receptorem mírně liší ve velikosti a složení genu pro TCR či Ig receptor a výsledek PARR je tak velmi rozmanitý (polyklonální). Nádorová transformace lymfocytů nastává obvykle poté, co buňky projdou receptorovým přeskupením. Nádorové buňky jsou klonem mateřské buňky a proto mají totožný receptorový antigen, který jepomocí PARR vyhodnocen jako monoklonální. Pokud neoplastická populace vychází z více klonů buněk, může být vzácně detekována jako bi- nebo triklonální.

Odběr a zpracování vzorků

DNA pro vyšetření PCR může být získaná rozličnými metodami. Vzorky na vyšetření tak můžeme zaslat z plné krve, jiných tělesných tekutin i tkáňových aspirátů ve zkumavce s médiem (např. EDTA) nebo přímo fixované na cytologickém sklíčku (barveném i nebarveném). Metoda odběru se tak oproti ostatním může stát pro pacienta zcela miniivazivní. Vyšetřit lze i ve formalínu fixované orgánové bioptáty nebo histopatologicky zpracované tkáňové bločky. Získané vzorky tedy lze i archivovat a podrobit je vyšetření později.

Indikace a limity PARR klonality

Jak bylo řečeno na začátku, důležitost PARR klonality spočívá v možnosti od sebe odlišit reaktivní (polyklonální) a neoplastickou (monoklonální) populaci lymfocytů. Největší význam má tato metoda v případech, kde jiné metody z určitých důvodů selhávají (viz níže) nebo nejsou z různých příčin proveditelné (finanční limity majitele, invazivita odběru vzorku versus celkový stav pacienta, atd).

Hlavní indikací PARR klonality je tedy diagnostika a základní imunofenotypizace lymfomů. B-lymfomy mají monoklonální Ig genové přeskupení, ale postrádají monoklonální genové přeskupení u TCR. U T-lymfomů je situace přesně naopak. Výhodou této vysoce specifické a senzitivní metody je schopnost detekovat klonální populaci (počínající lymfom) i v centru jinak benigní reaktivní populace. Toho se využívá především v diagnostice malobuněčných lymfomů (včetně alimentárních), kde díky současné zánětlivé infiltraci reaktivních lymfocytů nejsou běžné morfologické metody považované za zlatý standard diagnostiky lymfomu (histopatologie či imunohistochemie). Míra senzitivity se dle jednotlivých autorů liší. V závislosti na použitých primerech však dle studií publikovaných od roku 2012 dosahuje 80-100%. V některých případech indolentních či low-grade lymfomů tak můžeme být schopni detekovat toto onemocnění i před tím, než dojde k jeho klinické manifestaci, což má zásadní vliv na prognózu i terapii.

Kromě B a T-lymfomů byly popsány i tzv. duální lymfomy, které vykazují současnou monoklonální Ig a TCR pozitivitu. V některých případech se může jednat o dvě souběžně diagnostikovaná onemocnění – avšak s rozdílnou prognózou i terapií (např. současný výskyt high-grade B-lymfomu a low-grade T-lymfomu). Jejich výskyt je ale proti „duálním lymfomům“ z průtokové cytometrie výrazně nižší. U FCM v této souvislosti hovoříme o jednom onemocnění, které je spojeno s aberantní expresí CD markerů (např. CD79+ u některých T-lymfomů či CD3+ nebo CD8+ u některých B-lymfomů). V případě absence specifických protilátek proti ostatním CD znakům tak může být v těchto případech PARR klonalita užitečnou variantou pro definitivní určení diagnózy.

Je si však třeba uvědomit, že vyšetření PARR klonality by ostatní metody diagnostiky lymfomu nemělo nahrazovat, ale doplňovat. Pouhé určení B nebo T imunofenotypu totiž může být pro vyslovení prognózy i terapie zavádějící (např. Burkittův lymfom původem z B-buněk má signifikantně horší prognózu než jiné B a T lymfomy, oproti tomu některé malobuněčné T-lymfomy mají prognózu výrazně lepší a nasazení agresivního chemoterapeutického multiprotokolu je v takovém případě spíše odbornou chybou než přínosem pro pacienta). Některé  lymfomy mohou být navíc pro PARR diagnostiku nezachytitelné. Např. řada agresivních „large-granular“ lymfomů totiž vychází primárně z NK buněk, u kterých absentuje gen pro Ig i TCR. Pokud bychom u takového pacienta vycházeli pouze z výsledků klonality, nemohli bychom toto onemocnění vůbec diagnostikovat. Oproti tomu byly popsány i falešně pozitivní nálezy mono-/oligoklonální populace u některých infekčních onemocnění typických klonální expanzí lymfocytů (např. ehrlichióza či leishmanióza).

Samostatné užití PARR klonality není dostačující ani pro odlišení akutní leukémie od stage V leukemizujícího lymfomu (PARR nepřináší informaci o stupni zralosti buněk). Nelze jí  v této indikaci použít místo FCM.

V současnosti hraje PARR klonalita důležitou roli ve sledování minimální reziduální choroby (MRD), která spočívá v detekci neoplastických buněk během i po provedené terapii, kdy je pacient klinicky v kompletní remisi, ale při pozitivním nálezu MRD není v molekulární remisi. Význam zde mají i jiná paraklinická vyšetření jako sledování krevních biomarkerů, cytologie, histopatologie, imunohistochemie či FCM. Žádná z nich však nemá tak vysokou citlivost, jako je tomu u PARR (pro záchyt monoklonální populace stačí 1 neoplastická buňka mezi 10 000 normálními buňkami). I přes absenci klinických příznaků jsme tak schopni zjistit odpověď organismu na prováděnou terapii během samotné léčby nebo v rámci sledování klinické remise za použití minimálně invazivních metod (např. vyšetřením krve či aspirátu z postižených orgánů, dle indikace). Pozitivní výsledek MRD v průběhu léčby koreluje s horším přežíváním pacientů a je indikací k intenzivnější terapii.

PARR klonalitu není vhodné provádět v humánní laboratoři z důvodu absence specifických psích a felinních primerů. V ČR ji tak pro veterinární účely nabízí pouze laboratoř Laboklin (Německo, MVDr. Kateřina Škorová, czech@laboklin.com).

Reference

• Affolter, V.K., Moore, P.F., 2002. Localized and disseminated histiocytic sarcoma of dendritic cell origin in dogs. VeterinaryPathology 39, 74–83.
• Allison, R.W., Brunker, J.D., Breshears, M.A., Avery, A.C., Moore, P.F., Affolter, V.K., Vernau, W., 2008. Dendritic cell leukemia in a Golden Retriever. Veterinary Clinical Pathology 37, 190–197.
• Avery, A.C., 2012. Molecular Diagnostics of Hematologic Malignancies in Small Animals.The Veterinary Clinics of North America. Small Animal practise 42, 97–110.
• Avery, P.R., Burton, J., Bromberek, J.L., Seelig, D.M., Elmslie, R., Correa, S., Ehrhart, E.J., Morley, P.S., Avery, A.C., 2014. Flow cytometric characterization and clinical outcome of CD4+ T-cell lymphoma in dogs: 67 cases. Journal of Veterinary Internal Medicine 28, 538-546.
• Burkhard, M.J., Bienzle, D., 2013. Making Sense of Lymphoma Diagnostics in Small Animal Patients. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal practise 43, 1331–1347.
• Gelain, M.E., Mazzilli, M., Riondato, F., Marconato, L., Comazzi, S., 2008. Aberrant phenotypes and quantitative antigen expression in different subtypes of canine lymphoma by flow cytometry. Veterinary Immunology Immunopathology 121, 179–188.
• Kiupel, M., Teske, E., Bostock, D., 1999. Prognostic factors for treated canine malignant lymphoma. Veterinary Pathology 36, 292–300.
• Lana, S., Plaza, S., Hampe, K., Burnett, R., Avery, A.C., 2006. Diagnosis of mediastinal masses in dogs by flow cytometry. Journal of Veterinary Internal Medicine 20, 1161-1165.
• Marconato, L., Bonfanti, U., Stefanello, D., Lorenzo, M.R., Romanelli, G., Comazzi, S., Zini, E., 2008. Cytosine arabinoside in addition to VCAA-based protocols for the treatment of canine lymphoma with bone marrow involvement: does it make the difference? Veterinary Comparative Oncology 6, 80–89.
• Ponce F., Magnol J.P., Ledieu D., et al., 2004. Prognostic significance of morphological subtypes in canine malignant lymphomas during chemotherapy. Veterinary Journal 167, 158–66.
• Reggeti, F., Bienzle, D., 2011. Flow Cytometry in Veterinary Oncology. Veterinary Pathology 48, 223-235.
• Rossi, S., Gelain, M.E., Comazzi, S., 2009. Disseminated histiocytic sarcoma with peripheral blood involvement in a Bernese Mountain dog. Veterinary Clinical Pathology 38, 126–130.
• Yamazaki J., Baba K., Goto-Koshino Y., et al., 2008. Quantitative assessment of minimal residual disease (MRD) in canine lymphoma by using real-time polymerase chain reaction. Veterinary Immunology Immunopathology 126, 321–31.
• Vail, D.M., Young, K.M., 2007. Canine lymphoma and lymphoid leukemia. In: Withrow, S.J., Vail, D.M. (Eds.), Withrow and MacEwen’sSmall Animal Clinical
• Oncology, fourthed. Saunders Elsevier, Saint Louis, Missouri, USA, pp. 699–733.
• Vernau, W., Moore, P.F., 1999. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction.
• Veterinary Immunology Immunopathology 69, 145–164.
• Wilkerson, M.J., Dolce, K., Koopman, T., Shuman, W., Chun, R., Garrett, L., Barber, L., Avery, A., 2005. Lineage differentiation of canine lymphoma/leukaemia and aberrant expression of CD molecules. Veterinary Immunology Immunopathology 106, 179–196.

Autor

MVDr. Jakub Pfeifr
Veterinární klinika Animed
Blatnická 9, Brno
email: info@animed.cz