K čemu je vyšetření průtokovou cytometrií a PARR?

Souhrn: Diagnóza lymfomu psů je vícestupňový proces a je založená na klinickém vyšetření, hematologickém a biochemickém vyšetření krve, cytologii, průtokové cytometrii (FCM), histopatologii, imunohistochemii a v indikovaných případech na PARR klonalitě (PCR for Antigen Receptor Rearrangement). FCM zvyšuje senzitivitu a specifitu diagnózy u většiny subtypů lymfomu. FCM umožňuje určit imunofenotyp lymfomu, lze jí využít ke stagingu a gradingu lymfomu a díky zhodnocení aberantní exprese zpřesňuje prognózu onemocnění. FCM je jako rychlá a jednoduchá metoda součástí zlatého standardu diagnostiky lymfomu. Nevýhodou je nutnost vyšetřovat vzorky do 24 – 48 hodin od odběru, což s sebou přináší potíže z hlediska logistiky vzorků do laboratoře. PARR klonalita je PCR metoda, která je indikovaná v případech, kdy není histopatologické vyšetření a FCM proveditelné nebo je falešně negativní (zejména v případě vyšetření mozkomíšního moku či komorové tekutiny), dále v případech, kdy ostatní diagnostické metody nejsou schopné odlišit low-grade formy lymfomu od reaktivních či zánětlivých procesů (folikulární lymfom x reaktivní hyperplazie, IBD x low-grade alimentární lymfom). V neposlední řadě se PARR klonalita používá pro posouzení minimální reziduální choroby a monitoringu remise. Výhodou PCR je vysoká senzitivita a možnost provedení vyšetření z fixovaného materiálu (cytologické sklíčko či histopatologický bloček) i retrospektivně.

V současnosti jsme svědkem hlubokého pokroku v oblasti lymfomu psů, který umožňuje odlišit rozdílné subtypy lymfomu, které se často liší prognózou, mechanismem vzniku, odpovědí na terapii a do budoucna velmi pravděpodobně rozdílnou terapií. Tento pokrok umožňuje bližší srovnání lymfomu psů s humánním non-Hodgkinovým lymfomem a oboustrannou výměnu informací z hlediska etiopatogeneze, diagnostiky, prognózy a terapie (Daisuke 2014). Recentní studie od Marconato et al. (2013) poukazuje na skutečnost, že moderní klasifikace lymfomu psů dle WHO odlišuje subtypy s rozdílnou klinickou prezentací, imunofenotypem, morfologickými kritérii, odpovědí na terapii, přežíváním a odlišným doporučením pro terapii.

Doposud byla za zlatý standard diagnostiky lymfomu považována kombinace histopatologie a imunohistochemie. U řady indolentních forem či počínajícího stádia lymfomů nemusí vést tato diagnostická kombinace k správné finální diagnóze (Thalheim 2013). Pro diagnostiku humánního non-Hodgkinova lymfomu je rutinně používaná cytologie, histopatologie, imunohistochemie a průtoková cytometrie. Tento diagnostický přístup je doporučován i organizací European Canine Lymphoma Network Meeting, která zastřešuje veterinární onkology se zájmem o problematiku lymfomu psů. Většina veterinárních referenčních pracovišť v zahraničí tento model gold standardu postupně přijímá za svůj (Guscetti, Marconato, Comazzi 2013).

Pokud není provedení histopatologie možné (odmítnutí ze strany klienta, obtížná lokalizace lymfomu pro odběr core-biopsie), lze pro potvrzení diagnózy, určení imunofenotypu a přibližné prognózy použít kombinaci cytołogie a průtokové cytometrie (FCM). V případě technických a logistických překážek pro provedení FCM lze jako alternativu použít PARR klonalitu, kterou je možné provést i z fixovaných preparátů (cytologický preparát, preparát fixovaný ve formalínu, histopatologický bloček). PARR klonalita nenahrazuje histopatologické vyšetření, ani průtokovou cytometrii, ale v terénních podmínkách může být nejjednodušším a spolehlivým řešením pro potvrzení diagnózy lymfomu za cenu ztráty informací o konkrétním subtypu, jeho prognóze a optimální terapii (Burkhard 2012).

Průtoková cytometrie je bioanalytická metoda spojující principy fluorescenční mikroskopie a hematologického analyzátoru. Využívá fluorescenčně značených monoklonálních protilátek k detekci komplementárních antigenů na povrchu i uvnitř analyzovaných buněk. Vzhledem k vysoké senzitivitě, rychlosti vyšetření, široké paletě analytických možností a relativně nízké ceně za vyšetření se stala zlatým standardem v diagnostice hematopoetických malignit, kde je rychlá a přesná diagnostika vyžadována ke správnému stanovení diagnózy a následnému sledování průběhu léčby v reálném čase (Comazzi 2011).

Průtoková cytometrie je založená na principu vyšetření suspenze nádorových buněk, které jsou vystaveny laminárnímu proudění a průchodu přes optické paprsky, jejichž modifikace v důsledku optického odrazu a lomu od jednotlivých buněk je následně přeměňována na elektrický signál, který je vyhodnocován počítačem a dále elektronicky zpracováván (Reggeti 2011). Pomocí panelu protilátek proti povrchovým buněčným markerům (CD markery) lze u suspenze vyšetřovaných buněk zjistit jejich specifický imunofenotypový profil. FCM tak umožňuje odlišit reaktivní populaci lymfocytů od lymfomu, dále odlišit lymfom od jiných neoplazií (leukemie či thymom, histiocytární sarkom) (Affolter 2002).

Z pohledu vlastního lymfomu psů zjišťujeme pomocí FCM základní imunofenotyp buněk, tedy B-lymfom, T-lymfom či lymfom z buněk nulového typu (Comazzi 2011). FCM je elegantní metodou pro odlišení mediastinálního lymfomu od thymomu. Thymomy obsahují pravidelně populaci lymfocytů, které jsou současně duálně CD4+ a CD8+. Tato populace přesahuje 10 % všech vyšetřovaných buněk. Naopak mediastinální lymfom CD4+CD8+ populaci neobsahuje, nebo je její zastoupení nižší jak 2 % (Lana 2006). Navíc dokáže FCM odlišit rozdílnou velikost buněk mediastinálního lymfomu od lymfocytů thymomu, které jsou výrazně menší.

Diagnosticky obtížné je určení korektní finální diagnózy u pleurální, peritoneální a perikardiální efuze. Senzitivita a specifita cytologického vyšetření u psů se pohybuje okolo 60 %, respektive 99 % (Hirschberger 1999). U lidských pacientů s Non-Hodgkinovým lymfomem se incidence paraneoplastické pleurální efuze pohybuje mezi 20 – 30 %. Cytologická senzitivita pro potvrzení lymfomu je značně variabilní a pohybuje se mezi 20 – 90 %. Pro zpřesnění prognózy je proto rutinně používaná kombinace cytologie a průtokové cytometrie, kdy senzitivita a specifita dosahuje téměř 100 % (Das 2006).

Průtoková cytometrie posuzuje dále zralost lymfocytů, např. pomocí markeru prekurzoru lymfocytů, CD34 antigenu (Comazzi 2011). CD34+ populace je typická pro pacienty s akutní leukemií, nicméně CD34 antigen může vykazovat aberantní expresi i u některých dediferencovaných lymfomů. Ve studii Wilkersona et al. (2005) byla incidence CD34+ populace u lymfomů cca 5 %, veškeré případy byly B-buněčného původu. Možnost odlišit akutní lymfoblastickou leukemii (ALL) od lymfomu ve stádiu leukemizace (Stage V) má prognostický i terapeutický význam. ALL má obecně horší prognózu a odpověď na terapii než lymfom ve stádiu leukemizace (Kol 2013).

FCM posuzuje i míru exprese jednotlivých markerů, což má prognostický význam a v některých případech je imunofenotypový profil typický pro určitý subtyp lymfomu, čímž získáváme informace o přesnější prognóze a vhodné terapii lymfomu (Comazzi 2011). Dle studie Rao et al. (2011) je nízká exprese třídy MHC II a větší velikost buněk spojená s horší prognózou a zkráceným přežíváním ve srovnání s normální expresí antigenu či menší velikostí buněk. Podobný závěr potvrdila i studie Avery et al. (2014), která zároveň identifikovala rozdílnou prognózu a dobu přežívání u periferních T-lymfomů (PTCL) na základě exprese CD45 markeru. CD45+ lymfomy vykazovaly agresivní klinické chování a krátkou dobu přežívání (5 měsíců) ve srovnání s CD45- populací (střední doba přežívání 21 měsíců).

Klasifikace dle WHO rozlišuje řadu indolentních subtypů lymfomu psů, které zahrnují až 30 % všech diagnostikovaných lymfomů. Nejvyšší četnost (až 60 %) v rámci indolentních lymfomů vykazuje lymfom T-zóny (T-zone lymphoma, TZL), pro nějž je typická delší střední doba přežívání (cca 3 roky) (Flood-Knapik 2013). Diagnostika TZL je možná pouze pomocí histopatologie a imunohistochemie (IHC) či pomocí FCM. TZL mají specifickou morfologii a zároveň imunofenotypovou expresi. 100 % TZL diagnostikovaných v jedné studii pomocí histopatologie a IHC bylo CD45- (Seelig 2014). Zajímavý byl poznatek, že většina TZL projevovala lymfocytózu v periferní krvi a menší procento pacientů i paraneoplastickou hyperkalcemii. Jak přítomnost lymfocytózy, tak hyperkalcemie nebyla u TZL spojená s horší prognózou. Odlišení indolentní formy periferního T-lymfomu, tzv. TZL, od agresivní formy, tzv. PTCL-NOS (peripheral T-cell lymphoma, not other specified) má zásadní prognostický a terapeutický význam a je možné pomocí FCM.

Průtoková cytometrie určuje i tzv. pseudoklonalitu, tedy mono/oligoklonální zastoupení aberantní exprese markerů (Comazzi 2011). Tento klonální charakter je typický pro lymfom a naopak nepravděpodobný pro reaktivní hyperplazii lymfocytů. Nález pseudoklonality umožňuje potvrdit diagnózu lymfomu psů (Riondato 2006). Pseudoklonalita a aberantní exprese markerů je spolehlivým diagnostickým kritériem u malobuněčných T-lymfomů, které se pomocí histopatologie a IHC obtížně odlišují od reaktivní hyperplazie (Martini 2013).

Průtokové cytometrie se dále využívá pro posouzení stádia lymfomu psů, pro tzv.staging. Senzitivita FCM je vysoká a umožňuje záchyt nádorových buněk již od počtu 1 %. FCM je v kombinaci s cytologií ideální metodou pro posouzení infiltrace kostní dřeně (Comazzi 2011), tedy pro posouzení stádia (stage) V lymfomu. Tato informace má klíčový prognostický a terapeutický význam. Pacienti s lymfomem ve stádiu postižení kostní dřeně profitují z přidání cytarabinu ke kombinovanému chemoterapeutickému protokolu (Marconato 2008). Autorka předchozí studie, Marconato et al., v další studii z roku 2013 potvrdila, že v rámci skupiny pacientů s infiltrací kostní dřeně je prognostický rozdíl z pohledu střední doby přežívání na základě hranice 3% podílu infiltrujících nádorových buněk. Pacienti s hodnotou nádorových buněk nad touto hodnotou vykazovali velmi krátkou střední dobu přežívání (5 měsíců). Často je kritizována nízká citlivost FCM u orgánových biopsií chudých na nádorovou infiltraci (slezina, játra). Ve studii Joetze et al. (2012) byla míra falešně negativních výsledků z těchto orgánů cca 5 % a většina připadala na bioptáty z jater. V případě falešně negativního výsledku je vhodné provedení PARR klonality lymfocytů.

Pomocí průtokové cytometrie lze provádět grading lymfomu. Nejčastěji se využívá posouzení velikosti buněk a měření aktivity proliferačního markeru Ki-67 (Comazzi 2011). Aktivita Ki-67 koreluje s gradem lymfomu a umožňuje spolehlivě odlišit high-grade lymfomy od low-grade, což koreluje s prognózou a odpovědí na chemoterapii (Poggi 2013).

Důležitou schopností průtokové cytometrie je schopnost určit aberantní expresi markerů, která je vysoce specifická pro lymfomy a koreluje s horší prognózou pacientů (Comazzi 2011). Setkáváme se např. se smíšeným imunofenotypem, kdy nádorové lymfocyty exprimují markery jak B-, tak T-lymfomu, např. CD3+CD79+ populace. Smíšený imunofenotyp je obvykle spojen s horší odpovědí na terapii (Guija 2006). V citované studii byla četnost smíšeného imunofenotypu 30 %. Četnost aberantních imunofenotypů je překvapivě vysoká a dosahuje dle některých studií až 60 %. Častěji bývá nalézána u T-lymfomů (cca 75 %) (Gelain 2008). Vyšší incidence aberantního imunofenotypu ve stádiu V (leukemická fáze, infiltrace nelymfoidních orgánů a kostní dřeně) a substádiu b (klinické symptomy pacienta) nepřímo potvrzuje vyšší klinickou agresivitu aberantních imunofenotypů. Rovněž odpověď na terapii a střední doba přežívání je nižší (Burton 2014). Dle výše citované studie dosáhlo pouze 12 % pacientů během chemoterapie kompletní remise (stavu bez známek nádorového onemocnění).

Průtoková cytometrie se používá pro posouzení minimální reziduální choroby (MRD), což je potvrzení přítomnosti mikroskopického rezidua lymfomu u pacienta bez klinických známek onemocnění (Comazzi 2011). Vyšší senzitivitu poskytuje PARR, proto se od použití FCM v této indikaci částečně upouští. PARR může být ale v některých případech falešně negativní (nález polyklonální populace – nedostatečná citlivost primerů), a proto má FCM díky schopnosti detekovat aberantní imunofenotypy v diagnostice MRD stále své místo. Nález pozitivní MRD či její progrese koreluje spolehlivě s rozvojem recidivy lymfomu a obvykle jí předchází o několik týdnů. Možnost diagnostiky MRD tak zvyšuje záchyt časné recidivy lymfomu, což má opět prognostický i terapeutický význam (Sato 2011).

Průtoková cytometrie je velmi rychlou (analýza trvá několik hodin) a spolehlivou metodou pro diagnostiku lymfomu psů. Kromě potvrzení diagnózy přináší řadu prognostických informací, které mají své uplatnění v individuální terapii. Nevýhodouje omezený počet veterinárních laboratoří nabízejících FCM (humánní laboratoře jsou zcela nevhodné – nutnost psích protilátek a validity vyšetření pro psy), nutnost rychlého vyšetření nativních buněk (do 24 – 48 hodin od odběru), vysoká fragilita nádorových lymfocytů (riziko jejich poškození při transportu) a speciální pufr vyžadovaný některými laboratořemi pro transport suspenze buněk a nakonec falešná negativita vyšetření při punkcích chudých na vyšetřovaný materiál (mozkomíšní mok, komorová tekutina, některé punkce orgánů) (Comazzi 2011).

V našich podmínkách nabízí vyšetření pomocí FCM:

  1. VÚVeL (MVDr. Martin Faldyna: faldyna@vri.cz)
  2. Laboklin (MVDr. Kateřina Škorová: czech@laboklin.com)
  3. Idexx (MVDr. Zuzana Svobodová: svobodova@cymedica.cz)

Po domluvě lze zaslat vyšetření na FCM z ČR i na tato pracoviště:

  1. Vetmeduni Vienna (Barbara Rütgen DVM: barbara.ruetgen@vetmeduni.ac.at)
  2. St.Isztvan Uni. Budapest (Peter Vajdovich DVM: Vajdovich.Peter@aotk.szie.hu)

Další moderní metodou, která má v diagnostice lymfomu narůstající význam je PARR klonalita, která umožňuje detekovat monoklonální/oligoklonální populaci lymfocytů typickou pro lymfomy (Burkhard 2013). Pro specifickou imunitní odpověď lymfocytu je důležitý gen pro imunoglobulin, Ig (B-lymfocyt) či T-buněčný receptor, TCR (T-lymfocyt). Genetická informace pro Ig/TCR není děděna v definitivní podobě, ale ve formě genových segmentů (V, D, J), jejichž spojováním se vytvoří během diferenciace lymfocytů příslušné komplexní geny, jejichž informace je překládána do primární struktury Ig/TCR (Avery 2012). Pro přestavbu genů platí princip alelické exkluze, což v případě genu pro Ig znamená, že proces proběhne pouze na jednom chromozomu. Vzácněji nacházíme v nádorové populaci bialelickou rearanži. Byla však popsána i přestavba ve třech alelách u pacienta s trisomií chromozomu. Bialelická a trialelická rearanže je jedním z vysvětlení oligoklonálního charakteru PARR u některých lymfomů. U reaktivních procesů existuje značná variabilita repertoáru imunoglobulinů a Tbuněčných receptorů projevující se polyklonálním charakterem PARR klonality. Naproti tomu u lymfomů vycházejících z jednoho nádorového klonu, který se rozšířil a v populaci převážil, je tato variabilita redukována na monoklonální či oligoklonální repertoár (Byers 2008). Výhodou PARR je možnost provedení z fixovaného materiálu (cytologický preparát, vzorek ve formalínu či parafínový bloček), což umožňuje provést vyšetření PARR klonalitou kdykoliv a z čehokoliv. Nevýhodou původních metod byla poměrně vysoká falešná negativita vyšetření, která se pohybovala mezi 10 – 30% (Thalheim 2013). Falešná negativita znamenala neschopnost detekovat monoklonální/oligoklonální populaci lymfocytů a byla vysvětlována nižší senzitivitou používaných metod a nízkou specifitou používaných primerů. Pokročilejší metody PARR klonality uvedených v praxi mezi roky 2013 – 2014 dosahují výrazně lepších výsledků: senzitivita přes 90 % u B-lymfomů a 80 % u T-lymfomů, specifita 100 % u B- i T-lymfomů (Langner 2014).

Výraznou výhodou PARR klonality je vysoká citlivost metody, pro záchyt monoklonální populace dostačuje 1 nádorová buňka mezi 10000 normálními buňkami. Z hlediska množství vyšetřovaného materiálu je pro v současnosti používané metody dostačující hodnota 1 ng. Tato vysoká citlivost umožňuje detekovat lymfom z mozkomíšního moku, komorové tekutiny, efuzí a aspirátů orgánů v případech, kdy je cytołogie a FCM falešně negativní (Pate 2011).

PARR klonalita má zásadní význam pro detekci minimální reziduální choroby lymfomu (MRD). Podle studie Aresu et al. (2014) byla senzitivita pro detekci MRD z periferní krve a mízních uzlin u PARR 100 %, zatímco pro FCM 30 %. Záchyt MRD pomocí PARR klonality z periferní krve a mízních uzlin koreloval s vyšší než 90% pravděpodobností, což znamená, že detekci MRD je možné provádět jak z mízních uzlin, tak z periferní krve. Vývoj MRD po zahájení chemoterapie lze použít k predikci prognózy pacienta. Pozitivní MRD po zahájení chemoterapie koreluje s horší prognózou a zkráceným přežíváním pacientů (Sato 2013).

PARR klonalita a FCM umožňují detekci duálního imunofenotypu lymfomu. U FCM může dosahovat incidence až 30 % a ve většině případů je spojená s aberantní expresí CD markerů (především u T-lymfomů). U PARR klonality je tato incidence duálního imunofenotypu nižší (cca 5 – 10 %). Histopatologie a imunohistochemie je pro incidenci duálního imunofenotypu obvykle negativní (Thalheim 2013). Dle studie Avery et al. (2014) je možným vysvětlením duálního imunofenotypu u PARR klonality přítomnost duálního lymfomu. V citované studii předcházel často low-grade T-lymfom (TZL, T-zone lymphoma) vzniku high-grade B-lymfomu (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma), u některých pacientů byly oba dva lymfomy diagnostikovány současně. Během chemoterapie nedošlo u žádného z pacientů ke kompletní remisi onemocnění (lymfadenopatie u pacientů přetrvávala), PARR klonalita potvrdila u 60 % pacientů kompletní molekulární remisi B-lymfomu, ale přetrvávající nádorovou populaci low-grade T-lymfomu. Bez znalosti výsledku PARR klonality by onkolog pravděpodobně indikoval více intenzivní a agresivní chemoterapii. Díky PARR klonalitě bylo správným rozhodnutím u pacientů s molekulární remisí B-lymfomu pokračovat ve stávající léčbě (Avery 2014). PARR klonalitu proto doporučujeme provádět i u pacientů se známým subtypem lymfomu, který neodpovídá očekávaným způsobem na prováděnou terapii (možným vysvětlením je duální lymfom).

V humánní medicíně se PARR klonalita používá pro zjištění časných stádií lymfomu u chorob, které vzniku lymfomu předcházejí (gastritida spojená s infekcí Helicobacter pylori, céliakie, Crohnova choroba). Časná diagnóza umožňuje zahájit odpovídající terapii dříve než dojde ke klinickým projevům lymfomu (Avery 2004). Ve veterinární medicíně je podobná souvislost mezi rozvojem lymfomu a jinou chorobou známá u felinního IBD (prekanceróza low-grade alimentárního lymfomu) či u atypických infekcí (Ehrlichia canis či Bartonella henselae – prekanceróza multicentrického a splenického lymfomu). Správná terapie infekční příčiny může v rané fázi lymfomu vést ke kompletnímu vyléčení pacienta. Obtížné zůstává tak vysvětlit, kdy infekční či zánětlivé onemocnění lymfom pouze připomíná a kdy jsou lymfoproliferativní změny již tak hluboké, že dochází k nevratné progresi do lymfomu vyžadující cílenou onkologickou terapii. Některé případové studie ve veterinární medicíně ukazují, že diagnostické nálezy (cytologie, FCM, PARR) u atypických infekcí identifikují spolehlivě přítomnost lymfomu. Po přeléčení atypické infekce však může dojít k regresi lymfoproliferativních změn (Qurollo 2013). Otázkou, na kterou neznáme v současnosti odpověď, je, jakým způsobem by se vyvíjel klinický stav pacienta v případě, že by se zahájila chemoterapie bez předchozí eliminace infekce? Domníváme se, že by nastalo dříve či později zhoršení klinického stavu, které by se mylně interpretovalo jako rezistence lymfomu na terapii a jeho progrese. Objektivní studie k tomuto tématu ve veterinární onkologii chybí.

PARR klonalitu nabízí v ČR pro veterinární účely pouze tato pracoviště:

  1. Laboklin (MVDr. Kateřina Škorová: czech@laboklin.com)
  2. Vetmeduni Vienna (Barbara Rütgen DVM: barbara.ruetgen@vetmeduni.ac.at)

PARR klonalitu není vhodné provádět v humánní laboratoři, které postrádají specifické psí primery a validitu vyšetření pro lymfom psů.

FCM a PARR jsou nedílnou součástí zlatého standardu diagnostiky a monitoringu lymfomu psů. Jejich provedení je jednoduché a v ČR dostupné. Doporučujeme jejich provádění ve výše uvedených indikacích jako součást diagnostiky a péče o pacienty s podezřením na lymfom psů.

Autor

Profil Ondrej Škor

MVDr. Ondřej Škor
resident ECVIM-CA (oncology)
prezident Onkologické společnosti ČAVLMZ